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文久3年（1863年）2月5日、清河八郎が発案し江戸で結成された浪士組に同郷で芹沢家の家臣筋でもある平間重助を伴い参加し、六番組小頭に任命された。浪士組には、のちに江戸の剣術道場試衛館の近藤勇、土方歳三、沖田総司、山南敬助らも加わって、京都まで行動をともにする。
23日、京都に到着。芹沢は近藤一派とともに壬生の郷士八木源之丞の屋敷に分宿した。そのころ将軍の警固のため上洛した浪士組を、真の尊王攘夷の先鋒とするため、創設者である清河八郎は、朝廷に上奏文を提出して、浪士組を朝廷の直属にすることに成功した。29日、新徳寺に同志を集め攘夷の決行のため江戸帰還を宣言すると、芹沢と近藤はこれに反対し、京都残留を申し出て脱退。この時に残留を決めたのが芹沢の同志5人と近藤の同志8人の合計13人だった。これに殿内義雄や根岸友山らも合流する。
3月10日、芹沢、近藤ら17人（24人ともいう）の連名で会津藩に嘆願書を提出。会津藩は彼らを「御預かり」とすることを決める。芹沢らは八木家を屯所として（後に前川家と南部家にも寄宿）このとき「壬生浪士組」を名乗る。その際、内部抗争が起き、26日に殿内が暗殺され、根岸も同志とともに離脱すると、壬生浪士組は芹沢派と近藤派が牛耳ることになった。のちに芹沢、近藤、新見が局長となり、そのうちで芹沢が筆頭となった。
ただ、預かりとはなっていたが、
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は給金の支給がなかったため、4月になって芹沢、近藤らは大坂に下って商家から資金の提供を受けた。しかし、このような恐喝まがいの資金集めは会津藩の体面に関わることから、のちに藩より手当が支給された。
6月3日、芹沢、近藤ら10人が「不逞浪士」取り締まりのため大坂へ下った。途中、すれ違った力士が道を譲らなかったため、芹沢らは力士たちに暴行を加えた。その行為に怒った力士の仲間が駆けつけ乱闘となり力士側に死傷者が出た。相撲部屋（小野川部屋）の年寄が詫びを入れてことは治まったが、大坂町奉行所与力内山彦次郎がこれを問題にして近藤を怒らせ、のちに新選組により暗殺されている（内山を暗殺した者については異説もある）。
同月、水口藩の公用方が壬生浪士組は乱暴であると苦情を言ったことが会津藩を通して芹沢に知られ、激怒した芹沢は永倉新八、井上源三郎らを藩邸に派遣し、担当者を脅迫して謝罪させ、詫び証文を取った。詫び証文は担当者の独断で書かれたものであったため、ことの露見を恐れた公用方は詫び証文を取り返そうと人を介して芹沢を説得し、芹沢は詫び証文を返すこととなり、島原角屋で
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が開かれた。しかし酒乱の芹沢は大暴れをして店主の角屋徳右衛門に7日間の営業停止を一方的に申しつけている（角屋での暴挙）。
同年8月18日、八月十八日の政変に際して御所の警備のために近藤、新見とともに隊士を率いて出動するが、御門を固めていた会津藩士たちは壬生浪士組を知らなかったため槍を構えて通そうとしなかった。「通せ」「通さぬ」と双方が怒鳴りあう中、芹沢が哄笑しながら進み出て来た。会津藩兵が槍を突きつけると、芹沢は鉄扇でその槍先を悠々と煽いで笑う。会津藩の軍奉行が駆けつけて壬生浪士組を通してやり、芹沢は悠然と門を通った。人々は芹沢の剛胆さに驚いたという。（『新選組遺聞』）
この出動を機に会津藩は壬生浪士組に
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の隊名を与えた。
文久3年9月、芹沢が懸想していた吉田屋の芸妓小寅が肌を許さなかったため、立腹した芹沢が吉田屋に乗り込み、店を破壊すると主人を脅して、小寅と付き添いの芸妓お鹿を呼びつけ罰として2人を断髪させる乱暴を行っている（「浪士文久報国記事」）。
13日、近藤らは芹沢派の新見錦（この時は副長に降格）に乱暴狼藉の罪を問い詰めて切腹させた（「浪士文久報国記事」）。
14日、吉田屋での事件が問題となり、朝廷から芹沢の逮捕命令が出たことから、会津藩は近藤、土方、山南らに芹沢の処置を密命する。乱暴狼藉は表向きの理由で、水戸学を学び、天狗党の強烈な尊王攘夷思想の流れをくむ芹沢を危険視したという説もある。
16日、（「川瀬家文書」〜『
日経225
』による。『新選組遺聞』などでは18日）新選組は島原の角屋で芸妓総揚げの宴会を開いた。芹沢は平山五郎、平間重助、土方歳三らと早めに角屋を出て壬生の八木家へ戻り、八木家で再度宴会を催した。その席に芹沢の愛妾のお梅、平山の馴染みの芸妓桔梗屋吉栄、平間の馴染みの輪違屋糸里が待っており、すっかり泥酔した芹沢たちは宴席が終ると女たちと同衾して寝た。
大雨が降る深夜、突然、数人の男たちが芹沢の寝ている部屋に押し入り、同室で寝ていた平山を殺害し、芹沢に斬りつけた。驚いた芹沢は飛び起きて刀を取ろうとするが叶わず、真っ裸のまま八木家の親子が寝ていた隣室に飛び込むが、文机に転び、そこを刺客たちがよってたかってずたずたに斬りつけ、芹沢を殺すと刺客たちは立ち去った。
平山の死体は胴体と首が離れており、芹沢と同衾していたお梅も首を切られ惨殺された。別室にいた平間は逃亡。吉栄と糸里も難を逃れ姿を消したという。
『新選組遺聞』では、八木源之丞の妻まさが土方歳三が夜中にしきりに様子をうかがっているのを目撃しており、現場には沖田総司と原田左之助は確かにおり、山南敬助もいたのではないかと記している。永倉の「浪士文久報国記事」によると暗殺は土方、沖田、藤堂平助、御倉伊勢武らが実行したとある。西村兼文（新選組が屯所を置いた西本願寺の寺侍）の『新撰組始末記』では実行者は土方、沖田、山南、原田になっている。
18日説は『新選組始末記』『
外為
』が採るものであるが、18日夜には降雨がなく、降雨があったのは16日であるとして、16日説を推す意見もあり、いまだ定説はない。
事件は長州藩の仕業とされ、18日（18日暗殺説によれば20日）に芹沢と平山の葬儀が神式に則り盛大に執り行われた。事件の一連の経緯を20日に近藤は郷里多摩の佐藤彦五郎に手紙を送っている。
芹沢の墓所は京都市中京区の壬生寺にある。
芹沢の人となりについては、子母澤寛の“新選組三部作”（『新選組始末記』『新選組遺聞』『新選組物語』。いずれも中央公論新社から文庫版が出ている）に詳しいが、いずれもかなりの創作が入っているとされ史料的な正確さには非常に問題があることに留意する必要がある。
芹沢は背が高くでっぷり太っており、色白で目は小さかった。豪傑肌の一廉の人物で、常に「盡忠報國の士、芹澤鴨」と刻まれた鉄扇を手にしていた。酒が好きで、昼間から飲んでおり酔ってないことはなかった。
小説やテレビドラマでは手のつけられない凶暴な悪漢のように描かれることが多いが、会津藩主松平容保へ嘆願に行く時に八木家から紋付を借りることになり、全員同じ家紋になってしまうと八木源之丞が心配すると（公式の場では、かなり滑稽）、芹沢はまったく意に介せず笑っていたり、八木家から借りた火鉢をこっそり返しに来て、火鉢に刀傷があったので問いただしたら（隊士たちは酔って八木家の家財を手当たり次第に試し切りの材料にしていた）、「俺だ、俺だ」と頭をかいて逃げてしまうなど気さくな一面もあった。また、八木家の幼い娘が亡くなったときには、芹沢は近藤と帳場に立って進んで葬儀を手伝っており、暇つぶしに面白い絵を子供たちに書いてやるなど好かれていたという。
尊王攘夷の念が強く、北野天満宮に「雪霜に 色よく花の魁て 散りても後に 匂う 梅が香」という句を記した額を献じた。
新選組にまつわる物語に言われる芹沢が起こしたとされる「本庄かがり火事件」というのがある。浪士組時代に、京都へ向けて出発した一行が本庄宿で宿泊する際、宿割の近藤勇が芹沢の宿を取り忘れたことに端を発し、大篝火を炊くという話だが、これは近藤の宿割の辞令が14日付ということが判明し、創作の可能性が指摘されている。（分部家文書〜『新選組読本隊士外伝所収』）
芹沢の生家は江戸期以降、代々医業を続けており、現在の子孫も茨城県石岡市で診療所を開いている。現在も家伝薬「筋渡し」が処方されている。
芹沢鴨と水戸派は新選組物の映画やテレビドラマに登場することが多い。多くは粗暴な悪役で、暗殺事件が序盤でごく短く扱われる場合などは大柄な人相の悪い俳優が演じて、土方と沖田に簡単に成敗されるパターンが多い。芹沢が主要配役の場合をいくつか紹介する。
新選組血風録（1965年 - 1966年、NET系）
芹沢役は遠藤辰雄。芹沢と水戸派は極悪人そのもの。遠藤は悪代官役を多く演じた俳優で、水戸派は悪代官とその手下的な描かれ方である。土方から依頼されて新撰組の誠の旗をつくった染物屋の女主人を手ごめにし（女主人は恥じて自殺してしまう）、さらに罪のない職人の親方を斬り捨て、その弟子の職人たちと乱闘（大坂力士乱闘事件の改変）、あげくに親方の妹のお梅をまたも手ごめにする（お梅は発狂）など悪行をくりかえし、最後は土方と沖田たちに成敗される。典型的な勧善懲悪である。遠藤は『俺は用心棒』（1967年、NET系）、『新撰組』（1973年、CS系）でも芹沢を演じている。
新撰組（1987年、テレビ朝日）
芹沢役は地井武男。基本的に悪人だが腕が立つ一廉の人物。二夜連続ドラマの第一話の中心的な敵役。刹那的に非道を繰り返すが、どこか魅力がある描き方をされている。その他の水戸派は単なる悪漢のヤクザ的な配役。
新選組血風録（1998年、テレビ朝日）
芹沢役は松山千春。粗暴な悪人だが魅力のある人物として描かれている。暗殺の場面は史実に近くふんどし一丁で寝ているところを襲われ、ほとんど抵抗できず、めった斬りされている。その他の水戸派は人相の悪い大柄な俳優がそろい、ヤクザというより山賊である。腹心の新見錦役の岩尾正隆は強面の巨漢の俳優で、痩身な松山よりも芹沢のイメージに近い。
新選組!（2004年、NHK大河ドラマ）
芹沢役は佐藤浩市。悪人というよりは偽悪家といった性格付けであり、剣の腕前に加えて人望と学問も備えた一廉の人物として描かれている。主人公の近藤勇（香取慎吾）が越えなければならない壁とされ、ドラマの前半を支える重要な役柄となっている。「大河ドラマ史上最高の悪役」を狙ったという脚本の三谷幸喜は、佐藤の好演を評価して芹沢の出番を数話伸ばしている。暗殺場面ではすべてを察して土方、沖田、山南、原田を待ち構え、4人を相手に大立ち回りを演じる。その他の水戸派の面々も、ただの悪人ではない個性的な人物像で丁寧に描かれた珍しいドラマである。
輪違屋糸里（2007年、TBS）
芹沢役は中村獅童。とかく粗暴にして豪放な性格で描かれる由縁とも言える数々の行動の一つ一つにそれぞれ道理がある事を芹沢に語らせている。新見錦とともに試衛館一派を「田舎者」扱いしてはいるが試衛館派・水戸派といった派閥間の険悪なイメージは薄い。また、愛人お梅に関しても菱屋主人に棄てられて投げ鉢になった挙句あの時刻に芹沢と一緒の床にいたことになっている。浅田次郎原作の同名の小説を元にしたドラマ。
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