先物取引の手数料
壬生村の八木邸や前川邸などを屯所とし、第一次の隊士募集を行う。その結果36人余の集団となった壬生浪士組は、京都守護職・松平容保より、主に尊攘激派（勤王倒幕）浪士達による不逞行為の取り締まりと市中警護を任された。
同年8月に起きた八月十八日の政変に出動し、壬生浪士組はその働きを評価される。そして、新たな隊名を拝命する。ここに「新選組」が誕生した。なお、隊名は武家伝奏（当時は野宮定功と飛鳥井雅典）から賜ったという説と、会津藩主・松平容保から賜ったという二つの説がある。
池田屋事件跡文久3年9月、
外国為替
・土方ら試衛館派は、芹沢ら水戸派を粛清して隊を掌握し、近藤を頂点とする組織を整備する。元治元年（1864年）6月5日の池田屋事件では尊王攘夷派の蜂起の計画を未然に防ぎ、また、禁門の変でも戦った。
池田屋・禁門の変の働きで朝廷・幕府・会津藩より感状と200両余りの褒賞金を下賜されると、元治元年9月に第二次の隊士募集を行い、更に近藤が江戸へ帰郷した際に伊東甲子太郎らの一派を入隊させる。新選組は200人を超す集団へと成長し、隊士を収容するために壬生屯所から西本願寺（京都市下京区）へ本拠を移転する。慶応3年（1867年）夏頃には幕臣に取り立てられる。
慶応3年3月、伊東らの一派は思想の違いなどから
FX
を拝命して隊から分派するが、同年11月、新選組によって粛清される。
慶応3年11月に徳川慶喜が大政奉還を行った。旧幕府軍と共に鳥羽・伏見の戦いに参戦するも、新政府軍に敗北。その後、榎本武揚が率いる幕府所有の軍艦で江戸へと移動した。
新選組は幕府から、新政府軍の
CFD
を阻止する任務を与えられ甲陽鎮撫隊へと名を改め出撃するも敗戦。甲州勝沼の戦いの後、江戸に戻ったが、方針の相違から永倉新八、原田左之助らは分離して靖兵隊を結成した。近藤勇、土方歳三らは再起をかけ、流山へ移動するも、近藤勇が新政府軍に捕われ処刑され、沖田総司も持病であった肺結核の悪化により江戸にて死亡した。
新選組は宇都宮城の戦い、会津戦争などに参戦するが、会津では斎藤一等が離隊する。その後蝦夷共和国の成立を目指す榎本武揚らに合流し、二股口の戦い等で活躍する。新政府軍が箱館に進軍しており、弁天台場で新政府軍と戦っていた新選組を助けようと土方歳三ら数名が助けに向かうが土方歳三が銃弾に当たり死亡し、食料や水も尽きてきたので新選組は降伏した。旧幕府軍は箱館の五稜郭において新政府軍に降伏した。（箱館戦争）
局中法度（局中法度書）は「軍中法度」と並び新選組の規律維持のために定められたとされている。成立は会津藩預となった浪士組時代に近藤ら試衛館派から芹沢ら水戸派に提示されたと考えられている。
法として機能し始めたのは「新選組」と名を改め近藤・土方を中心とする組織が整ってからで、伊東甲子太郎ら一派の粛清の際にも適用されたといわれる。第一条「士道ニ背キ間敷事」など抽象的な内容で、解釈は局長や副長の一存に委ねられるものであった。鳥羽伏見の戦い以前に、新選組隊内において粛清された隊士は初代局長芹沢鴨や新見錦らを含めて41名である。
子母沢寛の著書『新撰組始末記』で紹介されて以来、有名となり、以下の5ヶ条として知られるが、同時代史料にはこれを全て記録した物は現在までのところ発見されていない。しかし、明治になってから永倉新八が残した回想録には、法度「禁令」という物があり ここには「私ノ闘争ヲ不許」を欠く4ヵ条が示されている。そのため、局中法度とは、この禁令に、別に定められていた「軍中法度」を混ぜて子母沢が創作したものと推測されている。また、天然理心流入門の際に誓約させられる神文帳との類似性も指摘されている。
後述する数々の創作物の影響もあり、幕末、
日経225
の治安維持の主力を担っていたのは新選組であるとの認識も一般には強いが、実際は重要な御所近辺は会津直轄隊の精鋭2000人、その周りは幕臣で構成される見廻組500人が固めていた。新選組はというと200人で伏見（当時は京都とは別の町であった）などを担当していた。
もっとも京都見廻組などが律儀に管轄を守っていたのに対し、新撰組は浪士の逃亡などを理由に管轄破りをすることも少なくなかったといわれる。
袖口に山形の模様（ダンダラ模様）を白く染め抜いた浅葱色（薄い水色）の羽織を着用していたとされ、映画などでは隊士はほとんどこの姿で表される。羽織のダンダラは忠臣蔵の赤穂浪士が吉良邸に討ち入りするときに着ていた羽織の柄で、浅葱色は武士が切腹の時に着る切腹裃の色だと伝えられているが、羽織は実際には最初の1年ほどで廃止されたらしく、池田屋事件の時に着用していたとする証言が最後の記録である。
作ったのは大文字屋呉服店（現在の大丸）。
くりっく365
では、大文字屋では無く「呉服問屋・菱屋」と言う話もある。また、誠の文字を染め抜いた隊旗は高島屋で作ったと言われている。
赤地に白字で「誠」を染め抜き、隊服と同じようにダンダラが入っていたとする隊旗が一般的。「誠」という字が旗が揺れたときに、近藤の実家「試衛館」の「試」に見えるからという理由も隠されているらしい。近藤派の存在を大きくしたかった土方の野望だとも言われる。
他にも隊旗があり全部で6種類あるとされている。また、その隊旗が現れたとき、敵は恐怖で凍りついたと言われる。この旗は現在の高島屋にあたる古着・木綿商によって特注で製作されたものである。
新選組は局長を頂点に副長が補佐し、以下に副長助勤・監察方（諜報）・勘定方（会計）などを配置した。副長助勤は組長として平隊士を統率した。各組は一番から十番まであり、各組の人員は十人前後。また、組長の下に伍長を置いた。なお、新選組の組織編制は、職務の複数制を原則とする江戸時代の各組織と違い一人制であり洋式軍制などの影響が指摘されている。
隊士達は日常的には武術の稽古や京都市内の見回りや潜伏している浪士の探索などを行った。剣術集団である新選組は、中心となる近藤ら試衛館の天然理心流に加えて神道無念流、北辰一刀流などさまざまな剣術流派に加え、槍術や柔術などを学んだ隊士もおり、実戦本意の集団戦法の集団であった。
結成当時には財政難であったと推測されるが、京都守護職配下時代は、隊の運営資金を会津藩からの御用金で賄っていた。また、一部は豪商などから提出させた。その後、幕府配下になると、各隊士は幕府から給料を得た。諸々の事件への出動により報償金が下されることもあった。
以下に構成員。新選組の隊名を用いる以前（壬生浪士組）の時期を含む。
芹沢鴨（せりざわかも、芹澤鴨、文政10年（1827年）?-文久3年9月16日（1863年10月28日））もしくは9月18日（10月30日））は、幕末の水戸藩浪士、新選組（壬生浪士）の初代筆頭局長。前名は下村嗣司。諱は光幹。家系は常陸平氏の平成幹の流れを汲むという平姓の芹沢氏。父は芹沢外記貞幹。
中世に興起した常陸国芹沢村（現茨城県行方市玉造町芹沢）の豪族、芹沢氏から発祥し、関ヶ原の戦功により幕臣となり、のちに水戸藩上席郷士（士分）となった芹沢家の当主貞幹の三男として生まれた。幼名は玄太。のちに松井村（現茨城県北茨城市中郷松井）の神官である下村祐斎の婿養子となり、下村嗣司と称した（継司、嗣次とも）。ただし、出自、出生年には諸説ある。たとえば島田魁の『英名録』には「芹沢又右衛門子」とあり、分家の出身ともいわれるが、水戸藩士の系譜を網羅する『水府系纂』に記載される芹沢又右衛門家の記述に該当する文言は見当たらない。なお、芹沢又右衛門家も祖先は芹沢外記家と同じ中世豪族の芹沢氏である。
武術は神道無念流剣術戸賀崎熊太郎に剣を学び、免許皆伝を受け師範代を務めた。
嗣司は尊王攘夷思想を貫徹するため、松井村を離れ、万延元年（1860年暮れ、天狗党の前身である玉造組に参加した。玉造村（現茨城県行方市玉造）を拠点として横浜で攘夷を決行するため石岡（現石岡市）、玉造、潮来（現潮来市）近辺の豪商、豪農を回り、資金集めに奔走した。このとき、玉造組では「進思尽忠」「無二無三大和魂」と記載された幟を掲げていた。嗣司はこのころから後世トレードマークとされた鉄扇を使用していた記録が残る（「伊能家文書」）。
しかし、文久元年（1861年）2月、水戸藩領だけでなく天領でも資金集めをしたことや天狗党を詐称して攘夷を口実とする恐喝が横行したことなどから、幕府から水戸藩に攘夷論者の活動の抑圧が指示され、水戸藩の方針は転換した。天狗党に近い藩首脳が更迭され、代わって反対派の諸生党が台頭すると、玉造組は即時に弾圧された。4月には嗣司も佐原方面での献金強要の罪で捕縛され入獄した（「鈴木大日記」）。処刑を待つ身だったが、文久2年（1862年）、住谷寅之助らによる朝廷工作が功を奏し、再度天狗党が藩の政権を奪取したことから、12月、安政の大獄に関わった政治犯の釈放を目的に大赦令が出され、出獄することを許された。この時、名を芹沢鴨に改めたという。